荧光原位杂交仪有哪些操作注意事项？

荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）技术问世于20世纪70年代后期，其基本原理是利用标记了荧光素的核酸作为探针，按照碱基互补原则，与待检样本中与之互补的核酸经过变性-退火而形成杂交双链核酸，通过荧光显微镜进行检测和分析。是一种在细胞遗传学水平上检测染色体及基因数目以及结构异常的一种分子生物学技术。该技术具有快速、安全、灵敏度高、探针可长期保存的特点，已广泛地应用于细胞遗传学、肿瘤学生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断等不同领域。

1 、开展FISH所需要的实验条件和人员培训

建立FISH技术平台，除需要一间可以进行荧光实验操作和显微观察暗室外，还需要原位杂交仪、荧光显微镜、显微镜滤光 片 、水浴箱 、漩涡混合器 、普通离心机 、移液器 、FISH探针试剂盒、无水乙醇、二甲苯、去离子水、橡胶水泥、透明指 甲油等设备和试剂。

由于FISH检测具有敏感性和客观性，任何一个步骤的微小失误均有可能对结果的判读产生偏差，进而对临床的合理用药产生影响，因此就对操作的技术人员在熟练和规范程度做出更高的要求。作者建议每一个开展分子病理检测的 病理科设置专门的分子病理室并由专人操作，并且要求专门的技术人员有相关的分子生物学理论知识，并经过专门培训，有一定的实验室工作经验。

2 、固定液的选择及固定时间

石蜡组织建议用 10%中性缓冲福尔马林固定 6~48h， 其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。组织离体后 应尽快固定，建议在标本离体后 30min内固定。如样本固定不及时，荧光信号会减弱。固定液的体积是组织体积的 4~20倍，否则固定不充分，容易出现无信号或者信号很弱的现象。而且，为了确保信号的准确性，蜡块尽量在2年内进行检测，已经切好的切片在 6周内检测为佳。

3 、组织切片和载玻片的选择

组织切片 4~5μm厚，过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响，而且切片应完整，质量良好，否则会在预处理 时掉片。载玻片的选择建议使用防脱载玻片，有条件的实验 室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片，可有效防止脱片现象的发生。

4 、实验过程中切片的预处理

切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。当组织 处理不规范、切片过厚或烤片不足时，在煮沸过程中容易掉 片，建议烤片温度在 56°C过夜。煮沸过程中要严格控制实 验温度和时间。酶消化是 FISH实验的关键步骤之一，如果 对组织不熟悉，可以先消化推荐的反应时间，然后复染DAPI在荧光显微镜下观察，在 DAPI通道下，以细胞既无空洞(消化过度)，亦 无明显 的云雾状 (消化不足 )为佳 ，同时可切换观察红绿通道，以红绿通道无明显的背景为佳，如果背景较高，可适当延长消化时间。另外，对于陈旧的石蜡组织切片，要适当延长消化时间，否则会出现大量的自发荧光。若 消化不足所致 FISH信号减弱或丢失，消化良好时FISH信号较好。

5、 变性和杂交

变性和杂交是本实验关键的步骤，变性的时间和温度是杂交成功是否的关键，为确保变性期间温度的稳定，建议采用专业的原位杂交仪进行变性和杂交步骤，不仅能够减少实验的繁琐性，而且更有利于实验条件的控制，比如时间、温度和避光条件等。为避免杂交液在变性和杂交过程 中的损失和防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。

6、 杂交后洗涤温度、时间和封片保存

杂交后的洗涤对于整个实验结果的影响非常重要，首先应确保正确配置杂交洗涤液 ，洗涤液温度偏高或时间过长 ，可导致信号减弱，洗涤液温度偏低或者时间过短，会产生杂信号过多、红绿信号对比性差或者特异性低等情况。

在复染完 DAPI以后，加盖盖玻片，用指甲油固定住盖玻片四角，这样可以防止在油镜下观察时盖玻片脱落。由于 荧光信号容易淬灭，所以在染色后应立即观察，如果当时不 能观察，可将切片放入切片盒中，保存于 -20°C冰箱里2周以内。

7、 设置对照

每次实验需设置标准对照:实验室在每一轮检测中均应使用标准化对照材料(阳性、阴性和可疑)。如果对照材料 没有显示预期的结果，则不能对结果做出判定。

8、 结果判读

应选择细胞核大小一致、核边界完整、DAPI染色均一 、 细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润性癌细胞核中的双色信号。判读标准参考专业书籍，对于FISH结果不确定的病例，需要再计算 20个细胞核中的信号或由另外一位病理诊断医师重 新计数。如仍为临界值，则应行免疫组化检测(若FISH检测前未行)，也可以选取不同的组织块重新检测。